配制聚丙烯酰胺凝膠前，應把玻璃管裝好。裝玻管的方式很多：在凝膠架的孔洞內，加少許40%蔗糖溶液，然后把洗凈干燥的玻璃管套上乳膠管，插入架的孔洞內，使玻璃管、乳膠管與孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶蓋封口，或者用附有玻璃短柱的乳膠管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在試管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培養皿中，然后用1%瓊脂趁熱倒在培養皿中，冷卻后，玻璃管口即被瓊脂凝膠封住。
配制凝膠時(shí)，先將所需的貯備液自冰箱中取出，放至室溫下預溫。
聚丙烯酰胺凝膠通常只制備二種膠。先制備分離膠，再在分離膠上面制備濃縮膠，樣品膠一般不制作，這是因為①有些樣品會(huì )抑制膠聚合；②光照可引起某些蛋白質(zhì)變性；③多了一道手續，延長(cháng)制膠時(shí)間。
分離膠的制備：按表4比例混合貯存液，(先不與過(guò)硫酸銨混合)，放在真空干燥器中抽氣，排除溶液中空氣。抽氣后在貯存液中加入過(guò)硫酸銨混勻，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入膠液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好標記，注膠到相同的高度。務(wù)必勿使氣泡出現。為了使凝膠表面平整，在凝膠表面再慢慢地加入一層水，約3～5mm高度，消除凝膠的彎月面。加水要小心，切勿沖亂界面。加水的另一作用是隔絕空氣中氧與膠液接觸。以防影響頂部膠層的聚合。注射器中殘留的膠液要立即清洗掉，以防膠液在針頭與注射器中聚合，而使其損壞。
水層放好后，靜置30分鐘，使凝膠進(jìn)行化學(xué)聚合反應。聚合最適溫度為25℃。當水剛加入膠面時(shí)，水與凝膠形成一界面，后界面慢慢消失，當凝膠聚合時(shí)，水與凝膠之間又出現界面。界面的再出現表明凝膠已經(jīng)聚合，再靜置20～30分鐘，聚合便完全。
分離膠的預電泳(此步驟應根據實(shí)驗的需要決定取舍)：凝膠聚合程度一般在90%以上。殘留的物質(zhì)，尤其是過(guò)硫酸銨，對某些樣品(如酶)會(huì )造成鈍化或引起其它人為效應。因此有時(shí)需要在正式電泳前，先用電泳方法去掉這些殘留物，稱(chēng)為“預電泳”。若直接用光密度計來(lái)掃描分離的區帶，則預電泳更為重要，因未聚合的丙烯酰胺單體對紫外光有較高吸收，會(huì )干擾測定。步驟：去掉玻管封口，倒出玻管中凝膠上的水分，并用分離膠緩沖液洗滌一下。把玻管插入電泳裝置中。上下電極槽中均加入分離膠緩沖液，預電泳的電流為3mA/管，時(shí)間需30分鐘～2小時(shí)。預電泳不能在制好濃縮膠后進(jìn)行，也不能用電極緩沖液進(jìn)行，不然會(huì )破壞不連續系統，而使濃縮效應失效。
濃縮膠的制備：分離膠聚合好后，或已經(jīng)過(guò)預電泳的分離膠，用注射器小心吸去水層，用濾紙條吸去殘余的水。按表4中比例混合濃縮膠液(也預先抽氣，抽氣時(shí)不要與核黃素混合，使用時(shí)再混勻)，先用這種凝膠液漂洗一下分離膠頂，去掉漂洗液后，再用注射器加濃縮膠溶液1cm左右，各管加的高度應一致，并在上面加水層壓平膠面。放在兩只20W以上功率的日光燈下，約離燈管10～15cm處，光下聚合60分鐘左右，當濃縮膠由淺黃色變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，即聚合完成，取出水層，吸干后用電極緩沖液洗滌，準備加樣。濃縮膠應臨用前制備。
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